Hubert Rehm, Thomas Letzel's Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics PDF

By Hubert Rehm, Thomas Letzel

ISBN-10: 3662488507

ISBN-13: 9783662488508

ISBN-10: 3662488515

ISBN-13: 9783662488515

Die überarbeitete und aktualisierte 7. Auflage dieses Buches gibt einen Überblick über bewährte und neue Methoden der Proteinbiochemie und Proteomics. Es zeigt Auswege aus experimentellen und strategischen Sackgassen. Zudem weckt es ein Gespür für das richtige scan zur richtigen Zeit. Behandelt werden klassische Verfahren wie Säulenchromatographie, HPLC, Elektrophoresen, Blots, ELISA, Ligandenbindungstests, die Herstellung von Antikörpern, das Solubilisieren von Membranproteinen, die examine von Glykoproteinen usw. Einen großen Raum nehmen die modernen Verfahren ein: Massenspektrometrie, Proteomics und thermische examine. In die 7. Auflage wurden neue Techniken zur Bestimmung der Wechselwirkung von Proteinen mit Proteinen oder von Proteinen mit kleinen Molekülen aufgenommen: DARTS, DRACALA, SPROX und andere. Des weiteren erfahren Sie, wie guy mit dem Massenspektrometer eine Bindung misst. Auch Methoden zur Herstellung von Bindungsproteinen gegen bestimmte Zielmoleküle werden vorgestellt: Ribosomen show und DNA- und Peptid-Aptamer-Techniken. Der Fluoreszenznachweis von Proteinen mit Hilfe von Trihalogenverbindungen durfte nicht fehlen und wer die Stabilität und Faltung von Proteinen messen will, kann hier nachlesen, ob er dazu ein CD-Spektrometer benutzen sollte. Auf die Fortschritte in der HPLC und der Massenspektrometrie von Membranproteinen wird ebenso eingegangen wie auf ihre Rekonstitution in Nanoscheibchen (Nanodiscs). Die Mikrodissektion mit UV-Laser, die isoelektrische Fokussierung in Kapillaren und iTRAQ-Tags werden erklärt. Dazu kommt eine Anzahl neuer tips zur Proteinbestimmung, Gelfärbung, Blottechnik, Immunfärbung, Elution aus Gelstückchen etc.

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Anderenfalls diffundiert beim Färben zu viel SDS aus dem Gel in die Färbelösung. Die SDSMizellen binden SYPRO Orange, was dessen effektive Konzentration erniedrigt. Zudem scheinen SDS-SYPRO-Orange-Mizellen den Hintergrund zu erhöhen. Und noch ein Tipp Messen Sie die Fluoreszenz auf Pyrex-Glasplatten. Andere Glasplatten zeigen Eigenfluoreszenz. Das mindert Klarheit und Empfindlichkeit der Färbung. Des Guten Feind ist das Bessere. Auch die SYPRO Farben haben inzwischen Konkurrenz bekommen: einen Fluoreszenzfarbstoff, der durch den Pilz Epicoccum nigrum synthetisiert wird.

Probleme Aus verdünnten Lösungen fällen Am- moniumsulfat und PEG das Protein nicht oder unvollständig, und die Fällung mit Ammoniumsulfat hinterlässt große Mengen an oft unerwünschten Ionen. Die organischen Lösungsmittel denaturieren manche Proteine auch bei tiefen Temperaturen. Apropos tiefe Temperaturen Falls Sie Ihre Proben auf −80 °C kühlen müssen und gerade kein Trockeneis vorhanden ist, können Sie im Tiefkühlschrank auf −80 °C gekühlten Aquariumkies verwenden (Laborjournal 5/2015; Ismalaj und Sackett 2015).

Und 2. Antikörpers mit dem Blot richten sich nach der Menge von Antigen und der Affinität der Antikörper. Meistens reicht eine Inkubationszeit von 1–2 h (RT) für den ersten bzw. 1 h (RT) für den zweiten aus. Der 2. Antikörper ist mit 125Iod, alkalischer Phosphatase (Blake et al. 1984) oder Peroxidase markiert und im Handel in guter Qualität erhältlich. Peroxidase hat in den letzten Jahren die anderen Marker verdrängt. Peroxidase-markierte Antikörper katalysieren die Oxidation von Luminol und lösen damit eine Chemilumineszenz aus; das entstehende Licht wird mit einem Film gemessen.

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Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics by Hubert Rehm, Thomas Letzel


by Paul
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